关键词：齐墩果酸、橙皮素；甲醇、乙醇、Cy5.5荧光标记试剂

Oleanolic acid–hesperetin co-assembled nanoparticles alleviate neurological injury after ischemic stroke via the PI3K/AKT/GSK-3β axis

NRR，October 24, 2026

https://doi.org/10.4103/NRR.NRRONLINE-D-26-00801

一、研究背景

超分子共组装纳米技术无需额外载体，依靠药物分子之间氢键、疏水作用、π-π 堆积等非共价作用自发形成纳米聚集体，可同步实现共载、增溶，提升生物利用度，同时降低载体材料带来的潜在毒副作用。PI3K/AKT 通路是调控神经元存活的核心通路，下游 GSK-3β 持续激活会促进线粒体凋亡通路启动；抑制 GSK-3β 活性、上调 BCL-2/BAX 比值，是减轻缺血再灌注神经元损伤的重要靶点。因此，本研究构建齐墩果酸 - 橙皮素无载体共组装纳米粒，评价其理化稳定性、生物相容性，从细胞水平与 tMCAO 动物模型层面验证神经保护效果，并围绕 PI3K/AKT/GSK-3β 轴阐明抗凋亡机制，为缺血性脑卒中天然药物递送新策略提供依据。

二、实验部分

1、材料

齐墩果酸、橙皮素；甲醇、乙醇等有机溶剂；HT22 海马神经元细胞；C57BL/6 小鼠；Cy5.5 荧光标记试剂；BCL-2、BAX、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、PI3K 等抗体。

2、OA-Hst NPs 制备

乳化 - 溶剂挥发法制备 OA-Hst 共组装纳米粒，筛选 OA:Hst 质量配比，确定最优 5:2 制备方案。

3、理化表征与稳定性评价

动态光散射检测粒径、PDI 与 Zeta 电位；透射电镜观察形貌；溶血实验评价血液相容性；连续 30 d 监测粒径变化评价储存稳定性；光谱检测联合分子动力学模拟分析分子间相互作用。

4、体外细胞实验

构建 HT22 氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤模型；设置对照组、模型组、游离药物组、OA-Hst NPs 组；CCK-8 检测细胞活力，流式与 TUNEL 染色检测细胞凋亡。

5、体内动物实验

建立小鼠tMCAO缺血性脑卒中模型；荧光示踪观察纳米粒脑部富集；TTC 染色评估梗死体积；干湿法测定脑含水量；Nissl 染色、FJ-C 染色、NeuN 免疫荧光评价神经元存活；神经功能评分、转棒实验、水迷宫检测 28 d 内感觉运动与认知功能恢复；Western blot 检测 PI3K/AKT/GSK-3β 通路及凋亡相关蛋白表达。

三、结果与讨论

1、OA-Hst NPs 理化性能与组装机制

在 5:2 投料比下成功制备球形共组装纳米粒，粒径均匀，分散性良好。极低溶血率证明其静脉给药具备良好血液相容性，长期储存粒径无明显变化，体系稳定性优异。光谱分析与分子动力学模拟证实，齐墩果酸与橙皮素之间存在氢键、疏水相互作用等多重非共价作用力，驱动二者自发组装，不需要额外高分子载体，降低辅料相关风险。

2、体外神经保护作用

OGD/R 刺激会造成 HT22 神经元大量凋亡、活力显著下降；游离齐墩果酸 + 橙皮素对照组保护效果有限，而 OA-Hst NPs 可显著提升细胞存活率，抑制凋亡发生，说明纳米组装结构提升了药物入胞效率，放大协同保护效应。

3、体内脑靶向与缺血损伤修复效果

Cy5.5 荧光结果证实纳米粒能够富集于缺血脑组织。tMCAO 模型结果显示，OA-Hst NPs 干预后梗死体积、脑水肿含水量明显下降；Nissl、FJ-C、NeuN 染色结果提示神经元丢失减少。长达 28 d 的行为学结果证明，该制剂可持续促进小鼠感觉运动与空间认知功能恢复，实现长效神经保护。

4、PI3K/AKT/GSK-3β 通路调控机制

OA-Hst NPs 可激活 PI3K，促进 AKT 磷酸化，进一步提升 GSK-3β Ser9 位点的磷酸化修饰，抑制 GSK-3β 激酶活性；上调抗凋亡蛋白 BCL-2，下调促凋亡蛋白 BAX，抑制线粒体凋亡通路，最终减少缺血应激下神经元程序性死亡。

四、结论

本研究成功构建齐墩果酸 - 橙皮素无载体共组装纳米粒，依靠分子间非共价相互作用实现两种天然活性分子共递送，改善水溶性与生物利用度。该纳米制剂可富集于缺血脑组织，通过激活 PI3K/AKT/GSK-3β 信号轴，上调 BCL-2、下调 BAX，抑制神经元凋亡，减轻脑水肿与脑梗死，长期改善缺血卒中小鼠神经与认知功能。该无载体共组装策略为缺血性脑卒中天然药物神经保护治疗提供了新的前药思路，后续仍需开展药代动力学、长期安全性以及通路上下游因果验证研究，推动其临床转化。

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