【Adv. Mater.】借助链缠结、硼酸酯键、离子网络与氢键构筑抗分层界面，原位共注射双层湿粘附水凝胶，用于牙周膜牙槽骨功能性再生。

A Tightly Interlayer Bonded, Synchronously In Situ CoInjectable, WetAdhesive, Hierarchically Biofunctionalized Bilayer Hydrogel for Functional Attachment and Orderly Periodontal Regeneration

Published: 2026 

https://doi.org/10.1002/adma.75042

一、研究背景

牙周组织是典型的软硬组织层级界面：牙槽骨承担硬组织支撑，牙周膜则通过定向胶原纤维把牙根牢固锚定在牙槽骨中。临床常用的引导组织再生膜和骨移植材料可以在一定程度上阻挡上皮侵入或提供骨传导支撑，但仍存在固定困难、降解与再生速度不匹配、生物活性不足以及结构过于单一等问题。

传统单层支架更难同时满足骨和牙周膜完全不同的力学与生物信号需求；而常规双层或多层支架又常因两层分别成形，跨界面聚合物链无法充分穿透，界面容易成为应力集中和分层的薄弱区域。此外，牙周缺损形状不规则、口腔环境持续湿润，预制支架难以严密贴合牙根与骨面。

更重要的是，骨再生和牙周膜纤维成熟并不同步：骨侧需要较早启动成骨信号，而牙周膜侧需要持续的细胞募集和胶原成熟信号。因此真正需要解决的并不是简单 “做一个双层水凝胶”，而是同时解决原位成形、层间抗分层、湿粘附、空间分区和时间分级生物调控这几个互相耦合的问题。在此背景下，作者设计了 PCAC/PCMC 双层水凝胶，实现牙周软硬组织的有序功能性再生。

二、实验

2.1 实验药品

海藻酸钠、聚乙烯醇（PVA）、4羧基苯硼酸（CPBA）、氯化钙（CaCl₂）、N羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1乙基3(3二甲氨基丙基) 碳二亚胺（EDC）、马来酰亚胺盐酸盐、MES 缓冲液、miR26a、阳离子脂质体转染试剂、含半胱氨酸的 PDGFBB 模拟肽、谷胱甘肽，以及人骨髓间充质干细胞和人牙周膜细胞等。

组分作用说明 

🍁PVA：作为两层水凝胶的主体高分子之一，其大量羟基与 CPBA 形成动态硼酸酯键，提供可逆交联、应力松弛和跨界面连接； 

🍁CPBA：提供硼酸基，与 PVA 构建动态网络，并参与湿表面的多重界面作用，是动态层间结合和湿粘附的重要来源； 

🍁海藻酸钠：与 Ca²⁺ 形成离子交联第二网络，提高结构稳定性； 

🍁AlgMAL：在海藻酸盐基础上引入马来酰亚胺，使 PCMC 能够共价固定含半胱氨酸的模拟肽； 

🍁Ca²⁺：提供快速离子交联，使双层前驱液同步挤出后迅速定型，同时参与界面离子网络； 

🍁miR26a：位于骨侧，通过抑制 GSK3β、增强 βcatenin/RUNX2 通路促进成骨； 

🍁阳离子脂质体：包封带负电的 miR26a，提高细胞摄取并延缓核酸降解和突释； 

🍁PDGFBB 模拟肽：位于牙周膜侧，持续募集牙周膜细胞并激活 PI3K/Akt，进一步提高 POSTN 和 LOX，促进胶原沉积、交联与有序成熟； 

🍁聚合物链缠结、动态硼酸酯、氢键和离子网络：共同跨越两层界面，分散局部应力，使界面强度超过相邻水凝胶本体的内聚强度，从而避免分层。

2.2 实验步骤

1、AlgMAL 合成：将海藻酸钠溶于 pH 5.0 的 MES 缓冲液，依次加入 NHS、EDC 和马来酰亚胺盐酸盐，室温反应 24 h；随后在 0.01 M HCl 中透析 3 d 并冻干，通过核磁和红外确认马来酰亚胺接枝。

2、水凝胶前驱液配制：A 液为 14%（w/v）PVA 溶于 1%（w/v）CaCl₂，B 液为 5%（w/v）海藻酸钠或 AlgMAL，并含 1%（w/v）CPBA；A、B 等体积混合后，最终水凝胶含 7% PVA、2.5% 海藻酸钠或 AlgMAL、0.5% CPBA 和 0.5% CaCl₂，分别命名为 PCAC 和 PCMC。 

3、构筑双层时，将 PCAC 与 PCMC 前驱液在 37 ℃ 预孵育后分别装入双筒注射器，通过 Y 型混合头同步共挤出，并在 1% CaCl₂ 条件下原位形成分层水凝胶。 

4、制备骨侧功能层时，使用 Lipofectamine RNAiMAX，将稀释后的脂质体试剂与 miR26a 按 1:1 体积比混合，室温孵育 10–20 min 得到 LipomiR26a，再加入 PCAC；细胞剂量筛选中 20 和 40 nM 无明显毒性，而 80 nM 降低细胞活力，因此后续采用 40 nM。 

5、制备牙周膜侧功能层时，将含半胱氨酸的 PDGFBB 模拟肽通过巯基马来酰亚胺反应接入 AlgMAL/PCMC 网络；剂量筛选显示 1–20 μg/mL 均可促进迁移，10 μg/mL 效果最突出，因此用于后续实验。6、最终通过同步共注射形成 PCMC@PDGF Peptide/PCAC@LipomiR26a 双层体系。动物实验使用雄性 SD 大鼠，拔除左下第一磨牙后，在第二磨牙近中建立 1.5 × 3 × 2.5 mm³ 牙周缺损，分别给予 PBS、商业膜 / 骨粉阳性对照、空白双层、PCAC@LipomiR26a、两种功能层物理混合的单层体系以及 BioFun bilayer；8 周后进行微 CT、组织学、胶原取向和免疫荧光分析。

2.3 测试表征方法

红外和核磁：验证 AlgMAL 的马来酰亚胺接枝及模拟肽偶联；

扫描电镜和原子力显微镜：观察孔结构与表面形貌；

压缩、拉伸、搭接剪切和 90° 剥离：评价层内力学、湿粘附与层间结合；

流变测试（应变扫描、频率扫描、黏度和应力松弛）：判断成胶稳定性以及两层能否实现黏度匹配共挤出；

溶胀和质量保留实验：评价 PBS、人工唾液及 MMP 条件下稳定性；

透射电镜、粒径和电位分析：评价 miR26a 脂质体；

释放实验：测定 miR26a 和模拟肽的持续释放；

细胞实验：CCK8、Live/Dead、Transwell、划痕、三维迁移、ALP、茜素红、RTqPCR、ELISA 和免疫荧光，评价成骨、细胞募集与纤维分化；

体内表征：微 CT、H&E、Masson、天狼星红偏振观察、胶原方向分析和免疫荧光，评价牙槽骨再生、牙周膜纤维成熟及相关信号通路。

三、结果与讨论

｜Scheme 1 原位可注射、层级生物功能化、湿粘附双层水凝胶用于功能性牙周连接和有序再生Scheme1A 从材料组成上说明双层并非简单叠加：PCMC 与 PCAC 都含 PVA/CPBA 动态硼酸酯和海藻酸盐 / Ca²⁺离子网络，但 PCMC 中进一步引入 AlgMAL，用于固定 PDGFBB 模拟肽；PCAC 则装载 LipomiR26a。两层在注射过程中同步成形，因此跨界面发生链穿插和动态连接。Scheme1B 把功能分工进一步展开：骨侧 miR26a 通过 GSK3β/βcatenin/RUNX2 促进成骨；牙周膜侧模拟肽通过 PDGF 受体及 PI3K/Akt–POSTN/LOX 促进细胞募集、胶原装配和纤维成熟。界面通过拓扑缠结、动态硼酸酯和离子 / 氢键实现抗分层，而外表面则通过多重相互作用稳定粘附湿润牙根和骨面。该 Scheme 完整展示全文 “结构分层 — 界面连接 — 湿粘附 — 时空生物调控” 的总体设计思路。

图 1 可注射湿粘附双层水凝胶的制备与表征图 1A 为 AlgMAL 合成；图 1B、C 为红外和核磁验证；图 1D 为 PCAC/PCMC 成胶；图 1E、F 为微观结构；图 1G、H 为压缩和拉伸；图 1I–L 为流变与黏度；图 1M 为双筒同步注射；图 1N 为双层荧光截面。AlgMAL 经 EDC/NHS 活化羧基接入马来酰亚胺；红外 1708 cm⁻¹ 羰基峰、1560 cm⁻¹ 酰胺 II 峰，核磁 6.9 ppm 烯烃质子峰共同证明改性成功。两层均由 “PVA/CPBA 动态硼酸酯 + 海藻酸盐 / Ca²⁺离子交联” 构成，区别仅在于 PCMC 使用 AlgMAL。SEM 显示两层具有相近连通多孔结构；力学测试得到 PCMC 压缩模量约 22.28 ± 5.48 kPa、拉伸模量约 43.90 ± 4.08 kPa，PCAC 分别约 12.74 ± 0.63 kPa 和 17.96 ± 0.53 kPa，分别适配牙周膜侧与骨侧力学需求。流变 G′高于 G″，黏度窗口接近，支持同步挤出；双筒注射 + 荧光截面直观证明成型后界面连续、维持双层而不混成单层。本图证实 “力学可分区” 与 “流变可匹配” 可以共存，是原位构筑双层的基础。

｜图 2 PCAC 与 PCMC 的湿粘附和层间整合图 2A 为不同湿组织上的粘附机制；图 2B 为搭接剪切；图 2C、D 比较牙槽骨、牙齿、牙周黏膜和猪皮粘附；图 2E 为活动关节贴附；图 2F、G 为双层剥离及力位移曲线。水凝胶依靠动态硼酸酯、氢键、离子作用和机械互锁实现湿组织粘附。搭接剪切定量：猪皮、口腔黏膜约 40 kPa；牙表面约 70 kPa；牙槽骨表面＞100 kPa。材料可在反复弯曲手指关节保持贴附，适配动态湿表面。90° 剥离时破坏优先发生在凝胶本体，而不是层间界面；力位移曲线平滑，无突然陡降。即便在降解条件下双层仍维持界面整体性，证明同步成胶带来的链缠结与动态键可以抵抗湿环境分层。

｜图 3 可注射双层水凝胶的层级生物功能化图 3A 为骨侧 miR26a 与牙周膜侧模拟肽的功能化路线；图 3B–E 为脂质体形貌、粒径、电位和细胞摄取；图 3F、G 为肽固定及红外验证；图 3H、I 为 miR26a 和肽的释放；图 3J 为双层空间分布。骨侧 PCAC@LipomiR26a，牙周膜侧 PCMC@PDGF Peptide 分区负载活性物质。TEM 显示脂质体球形，平均约 100 nm，包封率 78.78 ± 0.82 %；荧光摄取证实脂质体显著提升 miR26a 细胞内递送效率。巯基马来酰亚胺点击化学固定 PDGFBB 模拟肽，接枝效率 82.35 ± 3.47 %。释放曲线：脂质体保护使 miR26a 释放更平缓；共价固定模拟肽 120 h 累计释放仅 24.81 %，大部分保留在凝胶网络。荧光成像证明两种活性组分保留在各自层内，真正实现材料分层转化为功能分层。

｜图 4 PCAC@LipomiR26a 对骨髓间充质干细胞活力和成骨分化的影响图 4A 为成骨示意；图 4B、C 为细胞活性；图 4D、E 为 ALP 和茜素红；图 4F、G 为 RUNX2 与 OPN；图 4H、I 为三维免疫荧光；图 4J、K 为定量。miR26a 通过抑制 GSK3β 启动成骨程序。剂量筛选确定 40 nM 为安全有效浓度；CCK8 与活死染色证明良好相容性。ALP、茜素红染色显示功能组早期成骨与矿化结节明显增强；qPCR 结果第 7 天 RUNX2 约为对照组 20 倍，OPN 约 5 倍。三维免疫荧光及其定量进一步验证 RUNX2、OPN 蛋白上调，建立从安全剂量早期分化矿化基因蛋白完整成骨证据链。

｜图 5 PCMC@PDGF Peptide 对牙周膜细胞增殖、迁移和纤维分化的影响图 5A 为功能示意；图 5B、C 为 Transwell 迁移；图 5D、E 为划痕迁移；图 5F、G 为细胞相容性与增殖；图 5H、I 为三维迁移；图 5J 为相关基因；图 5K–N 为 POSTN、TNC 等蛋白表征与定量。牙周膜侧目标为先募集细胞，再诱导功能性纤维形成。Transwell、划痕实验证实 10 μg/mL 模拟肽促迁移效果最优；材料无明显细胞毒性，长期培养还可促进增殖。三维凝胶体系下细胞向内迁移增强；POSTN、PLAP1、TNC、TNN 等牙周纤维相关基因上调；免疫荧光定量确认 POSTN、TNC 细胞外基质蛋白表达提升。马来酰亚胺共价固定不会使模拟肽失活，可实现局部长期富集。

｜图 6 大鼠牙周缺损中的牙周复合组织整体再生图 6A 为缺损模型与治疗时间线；图 6B 为微 CT 二维 / 三维重建；图 6C–E 为 BV/TV、骨小梁数和骨小梁间距；图 6F、G 为 H&E 与 Masson 组织学。构建大鼠 1.5 × 3 × 2.5 mm³ 牙周骨缺损，8 周终点评价。微 CT 三维重建可见 BioFun bilayer 组新生骨连续，牙槽骨轮廓恢复最好；BV/TV、骨小梁数量显著提升，骨小梁间距得到改善。H&E 显示 PBS 组大量软组织侵入，空白双层新骨有限；BioFun bilayer 同时形成较多新骨以及排列连续的牙周膜样胶原纤维与血管。商业骨粉组虽有填充，但残留颗粒伴随炎症。该组图说明双层体系优势不在于简单填充缺损，而是同步改善骨软组织界面重建。

｜图 7 体内牙周膜纤维的功能性附着和有序排列图 7A 为天狼星红；图 7B 为偏振光和 I/III 型胶原染色；图 7C、D 为胶原定量；图 7E 为排列示意；图 7F 为方向雷达图；图 7G–M 为各组纤维角度分布。这是全文关键功能再生证据：BioFun bilayer 组观察到明显类似 Sharpey’s 纤维结构，一端嵌入牙骨质，另一端锚定新生牙槽骨，多数对照组难以实现同等双端锚定。偏振光、I/III 型胶原荧光证明胶原组成接近天然牙周膜。纤维方向雷达图与角度频率分布显示，BioFun bilayer 纤维角度集中有序；PBS、商业膜、空白双层等组别纤维方向分散无序。将评价标准提升到胶原组成、纤维取向、双端锚定的功能性指标，直接支撑题目中 functional attachment 与 orderly regeneration。

｜图 8 miR26a 成骨信号通路及体内外成骨标志物验证图 8A 为 GSK3β/βcatenin/RUNX2 机制；图 8B、C 为 GSK3β 和 βcatenin 表达；图 8D 为三维 βcatenin 免疫荧光；图 8E–G 为体内 RUNX2/βcatenin 及定量；图 8H 为共定位。miR26a 抑制 GSK3β，使 βcatenin 入核积累，激活下游 RUNX2 成骨转录程序。体外结果：GSK3β 下调，βcatenin 升高，免疫荧光信号增强。大鼠再生组织样本：含 miR26a 处理组 RUNX2、βcatenin 荧光信号显著高于 PBS、空白双层、商业阳性对照组；二者共定位增强。体内外互相印证骨侧 GSK3β/βcatenin/RUNX2 成骨轴的激活。

｜图 9 PDGF Peptide 的转录组与功能分析及 PCMC@PDGF Peptide 体外机制验证图 9A 为差异基因；图 9B–D 为功能、GO 和 KEGG 富集；图 9E、F 为 PI3K/Akt；图 9G 为关键基因热图；图 9H–J 为 LOX 基因和蛋白验证。转录组显示模拟肽处理发生 160 个上调、187 个下调基因，并非仅单一趋化效应。GO 富集指向细胞迁移、增殖、胞外基质组装；KEGG 富集指向 PI3K/Akt、黏着斑、肌动蛋白骨架通路。三维培养下 PI3K、Akt 蛋白表达上调；热图显示 LOX、POSTN 同步上调；qPCR、三维免疫荧光进一步确认 LOX 升高。LOX 可催化胶原共价交联，把机制从 “促进迁移” 推进到 “促进胶原网络成熟有序化” 层面。

｜图 10 BioFun bilayer 促进牙周膜功能性附着和有序再生的机制图 10A–C 为 PI3K/POSTN 免疫荧光及 PI3K 定量；图 10D 为 LOX/POSTN 双染；图 10E–H 为 POSTN 与 LOX 定量；图 10I 为 PI3K/Akt–POSTN/LOX 机制示意。体内组织荧光：BioFun bilayer 组 PI3K、POSTN 信号最强；单纯物理混合单层虽有提升，但弱于空间分区双层。LOX 与 POSTN 双染在功能双层样本中形成更广连续高表达区域。抑制剂反向验证：使用 LY294002 阻断 PI3K/Akt 后 POSTN、LOX 明显下调，加入模拟肽可部分恢复。最终机制通路：PDGFBB 模拟肽激活 PI3K/Akt，上调 POSTN 参与胞外基质组装，上调 LOX 促进胶原共价交联，协同实现纤维稳定、定向成熟。和图 7 的 Sharpey’slike 纤维结果形成完整 “分子信号胶原成熟功能性组织再生” 证据闭环。

四、全文总结

该工作的创新并不是简单制备一款双层水凝胶，而是把同步原位共注射、抗分层界面、湿组织粘附和时空生物功能化集成到同一套材料体系中。传统预制多层支架的固有短板是分步成型缺少跨界面高分子链穿透，界面先天薄弱；本工作利用同步共注射共同成胶，依靠链缠结与动态键从源头构建连续界面。预制支架难以适配不规则牙周缺损，该体系可以直接在湿润牙根、骨面原位成型，在牙槽骨表面粘附强度超过 100 kPa。

更关键的一点：研究没有将 miR26a 与 PDGFBB 模拟肽简单物理混合，而是进行空间分区递送：骨侧核酸实现较早持续释放启动成骨；牙周膜侧多肽共价锚定，实现长期局部富集，持续招募细胞并推动胶原有序成熟。评价体系不只观察缺损填充量，还考察胶原类型、纤维取向以及牙根牙周膜骨之间的双端锚定，真正把牙周再生研究从 “长出组织” 推进到重建 “软硬组织交界功能性连接” 的层面，也为软骨骨、肌腱骨等其它层级界面修复提供新设计思路。

1、结构层面：同步共注射工艺实现两层前驱液层流挤出，成型时高分子链跨界面互相穿插，拓扑缠结 + 动态硼酸酯 + 离子网络 + 氢键协同，使界面强度高于凝胶本体，有效抑制湿环境分层；流变匹配保证清晰空间分区，模量差异化适配骨、牙周膜不同力学微环境；材料具备合适降解溶胀行为，和组织再生时间尺度匹配。 

2、生物功能层面：骨侧 PCAC 装载脂质体包裹 miR26a，激活 GSK3β/βcatenin/RUNX2 通路促成骨；牙周膜侧 PCMC 通过巯基马来酰亚胺共价固定 PDGFBB 模拟肽，缓慢释放，激活 PI3K/AktPOSTNLOX 通路，实现细胞招募、胶原沉积、交联与定向成熟。 

3、体内效果：大鼠牙周缺损模型中，BioFun bilayer 组显著促进牙槽骨再生，形成类似天然 Sharpey’s 纤维的定向双端锚定牙周膜纤维，实现牙根牙周膜牙槽骨功能性连接，优于空白、物理混合组与商用再生膜。 

4、局限展望：本研究基于大鼠小动物模型，后续还需要开展大动物模型验证，进一步优化材料体内长期降解行为，推动向临床转化。

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